Problem Solved

没有方向的赶路，脚步只会越来越沉重。

我就像没头苍蝇一样的，这个星期在实验室要抓狂了。蛋白表达很好，但是就是不和磁珠binding；提取RNA和蛋白复合物，从来没有过的好的沉淀相，但是作northern信号太弱；明明测序正确的construct里面居然不能pcr出我要的片断。唉，每天这么累着，还没有个结果，一直每天提心吊胆，不知道每周的汇报能说些什么。

今天，日本博后度假归来，我和她好好谈了一下我的进度，两个人一起分析了好久，终于把问题找出来了。我们实验室用的TOPO cloning有两个kit，除了pENTR cloning外还有个连师姐都不知的TA cloning。这下好了，进了错的载体，这样抗性筛选两次都失效了，得到的colony是在错误的载体上的，蛋白表达是没有问题，但是没有his－tag了。pcr的问题应该是序列插入方向不对，造成clone的大小不对。这下子终于知道问题了。要不是给博后作的construct上的顺序颠倒了，估计我是不会想到事情还有这么一招的！！

今天好好休息，把construct都清理一遍，把实验步骤整理一下。明天，从头再来！！